发布时间2025-05-25 00:43:11 来源:小编 阅读次数:次
15、对◆■★。 0018 进一步的, 所述引物对包括甲基化引物对和非甲基化引物对★◆◆◆■; 所述甲基化引物对 的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示, 所述甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.3所 示; 所述非甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.4 所示, 所述非甲基化引物对的反 向引物序列如SEQ ID NO.5所示★◆■。 0019 进一步的★★■◆, 所述检测样本为外周血单个核细胞; 所述产品包括芯片或试剂盒。 0020 本发明所采用的技术方案之二是: 0021 提供一种用于早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的检测试剂盒, 所述试剂盒为 特异性检测MDM2甲基化的甲基化特异性PCR试剂盒◆★。 0★★★■■。
18、关肝细胞癌组的ROC曲线中A为乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、 肝硬化组、 慢性乙型病毒性肝炎组 的甲基化频率柱状图★◆■◆■, 图1中B为乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、 肝硬化组、 慢性乙型病毒性 肝炎组及阳性、 阴性对照组的凝胶电泳图。 具体实施方式 0030 为能清楚说明本方案的技术特点■■◆, 下面通过具体实施方式, 结合附图, 对本发明进 行详细阐述◆★■★。 0031 本发明主要收集山东大学齐鲁医院慢性乙型病毒性肝炎37例★★, 乙肝肝硬化31例★■■◆◆, 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌100例的外周静脉血★◆■★■◆。 0032 慢性乙型肝炎的诊断标准: HBsAg阳性6个月; 血清 HBVDNA20000IU/■★★。
19、mL (105copies/mL)◆◆◆, 或2000-20000IU/mL(104-105copies /mL)(常见于HBeAg阴性CHB患者); 持续性或间断性ALT/AST水平升高; 肝脏活检显示慢性肝脏炎症, 伴中度或严重坏死★★◆。 0033 肝硬化的诊断标准★◆◆★■■: (1)肝硬化经由影像学诊断; (2)超过半年的血清 HBsAg阳性 史; (3)明显的肝损害症状, 如肝病面容、 蜘蛛痣■◆◆◆、 肝掌等■◆◆◆; (4) 腹水, 静脉曲张出血, 肝性脑 病和/或黄疸★■。 0034 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断标准: 慢性乙型肝炎、 肝硬化等肝病背景下, 有影 像学检查结果(包括B超、 CT、 MRI及血管造影等)以★■■。
6、肝炎病毒感染诱发的肝癌更为普遍◆★★。 乙肝病毒感染及癌基因激活均在肝癌的发生 和发展中发挥着重要作用。 0003 表观遗传修饰是癌基因致癌作用中的重要事件之一, 其中包括异常的DNA 甲基 化■■◆★★◆。 DNA甲基化是指基因表达的可遗传变化★◆■★, 但是DNA序列没有发生改变。 DNA甲基化已在多 种肿瘤中广泛研究, 例如胃癌和肺癌。 多项研究表明, 某些基因的DNA甲基化可以用作诊断 的生物标记★◆■◆。 0004 MDM2是一种E3泛素连接酶, 其基因编码肿瘤抑制因子p53的负调控因子。 MDM2与 p53的转录激活域结合, 以调节p53的稳定和激活。 在正常的生理条件下◆■■◆■■, MDM2和p53形成一 个自我调节的负反。
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30◆★■■、on Buffer, 最高速离心30秒以洗脱DNA。 0095 洗脱的DNA可以即刻使用, 也可以-20或更低温贮存后使用。 如果要长期贮存, 最 好-70或更低温贮存。 每次PCR推荐使用1-4 l洗脱DNA, 但是如果必要的线 l。 根据实验要求不同洗脱液可以大于10 l, 但是较小体积的洗脱液可以得到更高 说明书 5/9 页 7 CN 112063717 A 7 浓度的DNA。 0096 4◆■.甲基化特异性PCR 0097 开始前注意事项◆■★■: 0098 本方法适用于25 l反应体系的制备, 反应体系0.05)◆★■★★。 0123 图3联合AFP与MDM2甲基化灵敏度为89◆◆.00。
2、(57)摘要 本发明涉及生物医学技术领域◆■◆◆■★, 尤其涉及 MDM2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌 早期诊断中的应用及检测试剂盒。 通过检测生物 标志物MDM2的甲基化频率, 可以在早期判断受试 者是否患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌, 及早进 行有效的治疗手段, 减低乙型肝炎病毒相关肝细 胞癌患者的死亡率, 提供更加及时的临床策略。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图2页 CN 112063717 A 2020.12.11 CN 112063717 A 1.检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的产品 中的应用◆★★, 其特征在于, 所述生物标志物为MDM2。 2.★◆。
4、括甲基化特异性PCR检测MDM2 甲基化频率的引物对。 7■★■.根据权利要求6所述的应用, 其特征在于◆■★★★, 所述引物对包括甲基化引物对和非甲基化 引物对; 所述甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO★■◆.2所示■■◆◆, 所述甲基化引物对的反向 引物序列如SEQ ID NO★◆.3所示; 所述非甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示, 所述非甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示。 8.根据权利要求1所述的应用, 其特征在于★■◆■◆★, 所述检测样本为外周血单个核细胞; 所述 产品包括芯片或试剂盒◆★★。 9.用于早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的检测试剂盒, 其特征在于, 所述试剂盒 为特。
21■◆■◆■★、淡黄色液体即为血浆, 下层为血细胞◆★■★◆■; 0039 (2)去除上层的淡黄色血浆, 按照1◆★: 1的比例加入PBS缓冲液, 缓慢吹打混匀; 0040 (3)15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液★◆■◆★, 吸取步骤(2)准备的稀释液沿管壁缓 说明书 3/9 页 5 CN 112063717 A 5 慢加入, 使稀释的血细胞悬液位于淋巴细胞分离液液面之上; 0041 (4)2000转/分转速离心20分钟; 0042 (5)缓慢取出离心管, 可发现管内液体分为4层★★, 从上到下依次为血浆层(淡黄色)、 PBMC层(白色膜状)■◆◆■、 淋巴细胞分离液层(透明)及红细胞和粒细胞层(红色、 难以区分)。 用吸 管小心地吸取P。
7、馈环, 以确保两者之间的平衡。 然而, 在各种肿瘤中经常观察到负反馈环 被破坏的现象。 尤其是MDM2过表达与多种肿瘤有关, 例如肉瘤、 结肠癌和胃癌◆★。 0005 目前, MDM2甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中的作用尚未有研究, 因此, 确定 MDM2甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的价值具有重要意义■★。 发明内容 0006 本发明提供了MDM2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用 及检测试剂盒, 通过检测样本中生物标志物MDM2的甲基化频率■★★◆, 可以在早期判断受试者是 否患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌, 及早进行有效的治疗手段, 减低乙型肝炎病毒相关肝 细胞癌患者的死。
16◆■◆■★、022 进一步的, 所述甲基化特异性PCR试剂盒包括以下引物对: 甲基化引物对的正向引 物序列如SEQ ID NO★■★■◆.2所示, 甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示★★; 非甲基化 引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示, 非甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO■★★.5所示★◆★★★★。 0023 进一步的■■◆■◆, 所述甲基化特异性PCR试剂盒还包括阳性对照、 阴性对照■■■★■◆、 Taq PCR Master Mix, 高压三蒸水。 0024 本发明的有益效果: 0025 本发明首先获得了MDM2甲基化频率在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的外周血 说明书 2/9 页 4 CN 11206371。
24■★◆★、5分钟); 0060 (4)离心后样品分为3层◆◆■■◆, 上层无色透明水相, 下层粉红色有机相■★◆◆■★, 两层之间为中间 层。 DNA主要存在于中间层和有机相中★★◆★★, 因此尽量移去上层水相■■◆★★◆; 0061 (5)加入O.3ml无水乙醇★■◆★■, 上下颠倒混匀◆◆, 室温静置1O分钟; 0062 (6)配平后, 放置于4离心机中离心(12000转/分★★■★, 5分钟)■★; 0063 (7)弃去上清液, 加入1mL 10乙醇O.1M柠檬酸钠溶液, 振荡洗涤DNA沉淀30分钟; 0064 (8)重复步骤(6)■◆★◆; 0065 (9)加入1ml 75乙醇, 振荡洗涤DNA沉淀30分钟; 0066 (10)重复步骤(6); 0067 (11)弃去上清。
14、TCGT 0012 T★◆:transcription start site。 0013 进一步的★◆■◆, 所述试剂为用于检测生物标志物的甲基化频率的试剂。 0014 进一步的, 当MDM2非甲基化时◆★■★★, 受试者患有早期乙型肝炎病毒相关肝细胞癌■★■◆。 0015 进一步的, 所述试剂包括引物、 探针■◆★、 抗体、 核酸芯片或蛋白质芯片。 0016 进一步的, 所述试剂包括PCR/Southern、 高通量测序平台、 结合重亚硫酸盐的限制 性内切酶法、 甲基化特异性多连接依赖性探针扩或甲基化特异性PCR 检测MDM2甲基化频率 的试剂。 0017 进一步的■★■◆, 所述试剂包括甲基化特异性PCR检测MDM2甲基化频率的引物。
20★■、及血清甲胎蛋白AFP 水平(AFP500 g/L★◆■, 且持续4周, 或AFP200-500 g/L持续8周, 在排除其他引起的AFP增高的因素)和/或穿刺活检 病理结果。 0035 排除标准: 合并其他肝炎病毒感染(甲肝病毒★◆★★★、 丙肝病毒、 丁肝病毒、 戊肝病毒 等)和/或人类免疫缺陷病毒; 患有其他肝脏疾病, 如自身免疫性肝炎、 酒精性肝病及代谢 性肝病等; 合并其他恶性肿瘤■◆★; 妊娠女性。 0036 所有患者均签署知情同意书■★。 0037 1.外周血单个核细胞分离 0038 (1)使用EDTA抗凝试管采集每位研究对象外周静脉血5ml, 离心(转速1500转 /分★■■, 5分钟), 可见全血分层, 上层。
5、异性检测MDM2甲基化的甲基化特异性PCR试剂盒。 10■■★◆★.根据权利要求9所述的检测试剂盒, 其特征在于■◆★◆, 所述甲基化特异性PCR试剂盒还包 括阳性对照★◆■■■★、 阴性对照、 Taq PCR Master Mix, 高压三蒸水。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112063717 A 2 MDM2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的 应用及检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物医学技术领域★◆★◆◆, 尤其涉及MDM2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝 细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒。 背景技术 0002 肝细胞癌是最常见的原发性肝癌, 也是全球癌症死亡的第三大主要原因。 在中国, 慢性乙型★◆★。
17、7 A 4 单个核细胞中是降低的, 并且明显低于慢性乙型病毒性肝炎患者和乙肝肝硬化患者的MDM2 甲基化频率, 确定了MDM2甲基化与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌具有关联性。 本发明提供的 生物标志物的甲基化程度能为早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌◆★■■◆, 可以作为诊断的依 据, 可及早进行有效的治疗手段■◆■◆★, 减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率提供更加 及时的临床策略。 附图说明 0026 图1为MDM2在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、 肝硬化组和慢性乙型病毒性肝炎组 的甲基化的差异; 0027 图2乙型病毒性肝炎组和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组的ROC曲线乙肝肝硬化组和乙型肝炎病毒相。
32■★◆★◆、56)。 0124 上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制★★■◆■, 对于本技术领域的技术人 员来说, 对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内★■◆◆。 0125 本发明未详述之处, 均为本技术领域技术人员的公知技术◆◆■。 说明书 7/9 页 9 CN 112063717 A 9 0126 说明书 8/9 页 10 CN 112063717 A 10 0127◆■。 说明书 9/9 页 11 CN 112063717 A 11 序列表 山东大学深圳研究院 MDM2 作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒 2020-09-15 4 SIPOSequenceL★■★◆■。
3◆◆■、根据权利要求1所述的应用, 其特征在于, 所述试剂为用于检测生物标志物的甲基化 频率的试剂。 3.根据权利要求1或2所述的应用, 其特征在于■★, 当MDM2非甲基化时, 受试者患有乙型肝 炎病毒相关肝细胞癌。 4★■★.根据权利要求1或2所述的应用, 其特征在于, 所述试剂包括引物★◆■★◆◆、 探针、 抗体、 核酸芯 片或蛋白质芯片。 5■◆■◆.根据权利要求4所述的应用■★, 其特征在于, 所述试剂包括PCR/Southern★■、 高通量测序 平台、 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法◆★、 甲基化特异性多连接依赖性探针扩或甲基化特 异性PCR检测MDM2甲基化频率的试剂★■。 6.根据权利要求5所述的应用◆★◆, 其特征在于■★★■★◆, 所述试剂包◆◆■■★◆。